Caspase-6 活性检测试剂盒

BB-4111

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产品概述 product description

贝博® BBcellProbe® Caspase 6 活性检测试剂盒(Caspase 6 Activity Assay Kit)是采用分光光度比色法定性检测细胞或组织裂解液中Caspase 6酶活性或纯化的Caspase 6酶活性的试剂盒。
贝博® BBcellProbe® Caspase 6 活性检测试剂盒是基于casepase 6可以催化Caspase-6底物（Val-Glu-Ile-Asp-pNA）产生黄色的pNA，pNA在405 nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 6的活性。
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。包含10多个成员。Caspase-6也称Mch-2，其前体蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚体，可诱导细胞凋亡。Caspase-6可剪切凋亡的关键调节蛋白PARP，剪切核膜上关键蛋白Lamin A，其对于Lamin A的识别位点是VEID。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100 μl的分光光度检测杯检测，可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-6检测。
贝博® BBcellProbe® 还可以提供荧光标记的Caspase-6 活性检测试剂盒（相关产品BB-41112）。荧光法检测的灵敏度远高于分光光度法，有荧光检测条件者尽可能选择荧光法的检测试剂盒。没有荧光检测条件，可以选择贝博的比色法Caspase-6活性检测试剂盒，需要确保样品中Caspase-6活化程度足够高。
贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、铁死亡、铜死亡、细胞自噬、衰老、焦亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、信号传导、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、糖酵解、缺氧、细胞内pH、细胞粘附、细胞形态、生长、分化、迁移等数百种细胞检测试剂盒产品。

保存温度

2-8℃

注意事项

1. Caspase-6底物短期4℃避光保存，长期-20℃避光保存；。
2. Caspase底物在冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3. 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。

有效期

一年

适用样本

1. 细胞
2. 组织

仪器准备

1. 酶标仪/分光光度计
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒

试剂准备

PBS缓冲液或HBSS

耗材准备

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套

使用注意事项

1. 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
2. 须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100μl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405。
3. 37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。
4. 如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500ug每样。
5. 如果样品中激活的caspase水平很低，适当调节诱导细胞凋亡的时间，找一个caspase激活比较强的时间点进行检测。
6. Caspase-6底物避光保存，使用过程中尽量避光。
7. 底物为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
8. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。

使用方法

一、裂解缓冲液和检测缓冲液配制
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1 ml缓冲液中加入10 μl DTT。
充分混匀置冰上备用。

二、样品处理
A．细胞样品
1. 收集2-5×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50 μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置2-8℃持续振荡15-30分钟。
5. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。

B．组织样品
1. 取适量组织样本，用手术剪刀尽可能剪碎。
2. 按照50 mg/100 μl加入冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 在2-8℃振荡15-30分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
4. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上保存备用。

三、对上述处理过的上清进行蛋白定量。

四、 Caspase 6活性检测
1. 取50 μl大约含100-200 ug蛋白的裂解上清，加入40 μl检测缓冲液。
2. 再加入10 μl caspase-6底物，充分混匀。在37℃下避光反应1-4小时，有黄色颜色产生即可进行检测，如果颜色变化不明显，时间可以延长，甚至孵育过夜。部分样品中激活的caspase-6水平较低，颜色变化不明显，直接上机检测，与对照组样品产品变化即可。
3. 测定A405 nm或A400 nm。
4. 根据凋亡诱导的细胞的吸光值与对照细胞样本的吸光值的比值计算相对的Caspase 6活性程度。

常见问题分析

OD值偏低
比色法caspase-6活性检测方法常见的问题主要为测得的OD值偏低，颜色变化不明显，无法显示与对照组细胞的差异，其可能的原因主要集中在以下几个方面：
1. 样品上样量不够：本方法检测需要的细胞数量须在3×106以上，或者新鲜组织50 mg以上，每次反应的蛋白量需要在100 μg以上。如果量不够，请增加细胞或组织的量。
2. 样本不新鲜：使用新鲜的细胞或组织样本。
3. 样品裂解不够充分：细胞或组织需要进行充分裂解，最好可以加入适当的蛋白酶抑制剂混合物裂解，裂解后应无明显大量的沉淀，以保证有效获得蛋白。
4. 样品中激活的caspase-6水平偏低：首先确认模型的凋亡现象是否明显，以及根据文献和其他验证方法确认该凋亡是否激活caspase-6。
5. 检测时间点的选择是否合适：不论哪种通路的凋亡，需要在caspase-6被有效激活并达到相应活化程度后的一定时间范围内检测，过早或过晚均不合适。
6. 不适合本方法检测：某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能是非依赖于caspase-6活化的机制，此种情况时利用本试剂盒检测caspase-6无明显变化，需要考虑凋亡机制的其他通路。

参考文献

1. Lin Liu et al.
Peptide-functionalized upconversion nanoparticles-based FRET sensing platform for Caspase-9 activity detection in vitro and in vivo
Biosensors and Bioelectronics 2019 （IF=9.518）

2. Yuanxin Zhang et al.
DNA-Hybrid-Gated Photothermal Mesoporous Silica Nanoparticles for NIR-Responsive and Aptamer-Targeted Drug Delivery
ACS Appl. Mater. Interfaces 2015 （IF=8.456）

3. G Wang et al.
The JAK2/STAT3 and mitochondrial pathways are essential for quercetin nanoliposome-induced C6 glioma cell death
Cell Death and Disease 2013 （IF=6.044）

4. Ting Li et al.
Differential effects of polyphenols-enriched extracts from hawthorn fruit peels and fleshes on cell cycle and apoptosis in human MCF-7 breast carcinoma cells
Food Chemistry 2013 （IF=5.399）

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