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产品概述
product description
贝博® BBcellProbe® 线粒体膜电位检测试剂盒（RHO123）是利用Rhodamine 123探针检测线粒体膜电位变化的试剂盒，可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，可以用于早期的细胞凋亡检测。 粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。Rho123是一种可以通透细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，广泛用作检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)的荧光探针。Rho123是阳离子荧光染料，在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质。在细胞凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃，Rho123 重新释放出线粒体。通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化，可用于培养的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电位检测。 贝博® BBcellProbe® Rho123可以快速通过细胞膜，仅需几分钟就可以被具有活性的线粒体所俘获，并且对细胞没有任何毒性。Rho123的最大激发波长为507 nm，最大发射波长为529 nm。在荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光。
保存温度
-20℃避光
注意事项
1.JC-1染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。
2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
有效期
1年
检测方法
1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
适用样本
1.悬浮细胞
2.贴壁细胞
2.贴壁细胞
产品应用
1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
仪器准备
1.流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
试剂准备
1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.铝箔
2.吸头
3.一次性手套
4.铝箔
使用注意事项
1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3.始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。
4.根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
5.线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。但是结果分析时注意排除荧光淬灭现象，Rho123荧光物质的激发光谱和发射光谱有一部分是重合的，其发射光有一部分（与激发光重合的部分）会被自己重新吸收，而且这种吸收的效益随着该荧光物质的浓度增加而增强。换而言之，当荧光物质浓度很高的时候其荧光强度和浓度的增加不成正比，此时注意检测结果的分析。采用JC-1法可以减少荧光淬灭的影响。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3.始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。
4.根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
5.线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。但是结果分析时注意排除荧光淬灭现象，Rho123荧光物质的激发光谱和发射光谱有一部分是重合的，其发射光有一部分（与激发光重合的部分）会被自己重新吸收，而且这种吸收的效益随着该荧光物质的浓度增加而增强。换而言之，当荧光物质浓度很高的时候其荧光强度和浓度的增加不成正比，此时注意检测结果的分析。采用JC-1法可以减少荧光淬灭的影响。
使用方法
悬浮细胞
1. 试剂配制：
1X染色缓冲液配制：
根据样品数按下列比例配制1X染色缓冲液，取100 μl 10×染色缓冲液加900 μl纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×染色缓冲液；
Rho123染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制Rho123染色工作液。在500 μl 1×缓冲液中加入4 μl Rho123，混匀配成Rho123染色工作液。
2. 收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。
3. 用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。
4. 用500 μl Rho123染色工作液将细胞重悬，细胞密度约5-10X105个/ml。37℃，5% CO2的培养箱中孵育15分钟。
5. 常温离心收集细胞。 用PBS洗涤细胞1次。
6. 用500 μl预热的1X染色缓冲液将细胞重悬。
7. 用流式细胞仪或荧光酶标仪/分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。
贴壁细胞
对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
纯化线粒体
1． 把配制好的RHO123 染色工作液再用RHO123孵育缓冲液(1×)稀释5 倍。
2． 0.5 mL 5倍稀释的RHO123 染色工作液中加入0.1 mL 总蛋白量为10～100ug的纯化的线粒体。
3． 结果检测。
组织样本
组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。
结果分析 ：
检测时可以把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm。
线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。
用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的情况。
也可以用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察；用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测。
1. 试剂配制：
1X染色缓冲液配制：
根据样品数按下列比例配制1X染色缓冲液，取100 μl 10×染色缓冲液加900 μl纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×染色缓冲液；
Rho123染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制Rho123染色工作液。在500 μl 1×缓冲液中加入4 μl Rho123，混匀配成Rho123染色工作液。
2. 收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。
3. 用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。
4. 用500 μl Rho123染色工作液将细胞重悬，细胞密度约5-10X105个/ml。37℃，5% CO2的培养箱中孵育15分钟。
5. 常温离心收集细胞。 用PBS洗涤细胞1次。
6. 用500 μl预热的1X染色缓冲液将细胞重悬。
7. 用流式细胞仪或荧光酶标仪/分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。
贴壁细胞
对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
纯化线粒体
1． 把配制好的RHO123 染色工作液再用RHO123孵育缓冲液(1×)稀释5 倍。
2． 0.5 mL 5倍稀释的RHO123 染色工作液中加入0.1 mL 总蛋白量为10～100ug的纯化的线粒体。
3． 结果检测。
组织样本
组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。
结果分析 ：
检测时可以把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm。
线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。
用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的情况。
也可以用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察；用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测。
常见问题分析
1.出现凋亡细胞荧光强度高于正常对照细胞的情况？
Rho123染色检测线粒体膜电位时，理论上一般正常情况均是随着细胞凋亡，线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。
但是Rho123染料的特性决定不同的细胞类型、染色方式、染液浓度、染色与处理的顺序等因素都可以明显影响Rho123的染色结果。其中影响最显著的是细胞ΔΨm（Rho123的总摄入）、细胞质膜的Pgp（P-糖蛋白）/ MRP（多药耐药相关蛋白）（Rho123的胞内保留）和Rho123的self-quenching等3个因素。
当某些模型中质膜Pgp外排的影响或者线粒体中Rho123浓度很高导致的荧光self-quenching的影响超过了MMP降低的影响时，会出现凋亡细胞（膜电位降低细胞）的荧光强于对照细胞的现象，但此时胞内的Rho123主要分布于胞浆中，而不是线粒体内。
还有一些比较少见的情况是，有些模型的ΔΨm在细胞凋亡早期会有一过性升高，Rho123染色会一过性增强，如果检测的时间点恰好重合，也会出现凋亡细胞荧光强度高于正常对照细胞的现象。
Rho123染色检测线粒体膜电位时，理论上一般正常情况均是随着细胞凋亡，线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。
但是Rho123染料的特性决定不同的细胞类型、染色方式、染液浓度、染色与处理的顺序等因素都可以明显影响Rho123的染色结果。其中影响最显著的是细胞ΔΨm（Rho123的总摄入）、细胞质膜的Pgp（P-糖蛋白）/ MRP（多药耐药相关蛋白）（Rho123的胞内保留）和Rho123的self-quenching等3个因素。
当某些模型中质膜Pgp外排的影响或者线粒体中Rho123浓度很高导致的荧光self-quenching的影响超过了MMP降低的影响时，会出现凋亡细胞（膜电位降低细胞）的荧光强于对照细胞的现象，但此时胞内的Rho123主要分布于胞浆中，而不是线粒体内。
还有一些比较少见的情况是，有些模型的ΔΨm在细胞凋亡早期会有一过性升高，Rho123染色会一过性增强，如果检测的时间点恰好重合，也会出现凋亡细胞荧光强度高于正常对照细胞的现象。
参考文献
1.Lingqi Zhou, et al.
Cyclovirobuxine D inhibits cell proliferation and migration and induces apoptosis in human glioblastoma multiforme and low‑grade glioma
Oncology Reports 2020
2.ChuanPing Feng, et al.
Evaluation of the effects of the water-soluble total flavonoids from Isodon lophanthoides var.gerardianus (Benth.) H. Hara on apoptosis in HepG2 cell: Investigation of the most relevant mechanisms
Journal of Ethnopharmacology 2016
Cyclovirobuxine D inhibits cell proliferation and migration and induces apoptosis in human glioblastoma multiforme and low‑grade glioma
Oncology Reports 2020
2.ChuanPing Feng, et al.
Evaluation of the effects of the water-soluble total flavonoids from Isodon lophanthoides var.gerardianus (Benth.) H. Hara on apoptosis in HepG2 cell: Investigation of the most relevant mechanisms
Journal of Ethnopharmacology 2016
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