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贝博® BBcellProbe® 细胞周期检测试剂盒是利用细胞内DNA能够和荧光染料结合的特性，细胞各个时期其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样来检测细胞周期。 细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。 本试剂盒中的BBcellProbe® NucGreen L1核酸荧光染料为绿色荧光的核酸染料，能选择性的嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。NucGreen L1染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧 光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。 常规细胞周期检测试剂盒采用PI染料，当细胞自身有红色荧光时，不能用PI进行细胞周期检测，贝博NucGreen L1适合用于细胞自带红色的细胞样本的周期检测。 除了本试剂盒提供的绿色荧光细胞周期检测产品，贝博还能提供红色、蓝色、橙色、深红色等荧光颜色的细胞周期检测试剂盒产品。
2.试剂拆封后请尽快使用完！
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
2.吸头
3.一次性手套
2.最好使用含EDTA的细胞消化液。
3.洗涤细胞离心转速不可超过800×g。
4.乙醇固定时离心大概采用2000×g力5分钟，离心力太小可能部分细胞难以沉淀。
5.固定时在振荡器上轻轻振荡细胞，并缓慢滴加75%乙醇，直接加入会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。或者先用冷PBS悬浮细胞，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-90%乙醇。乙醇固定之后须无细胞沉淀。
6.为防止不同批次细胞在实验时本身所出周期不同导致重复性差，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期，不能是完全长满，一般在50～80％比较好。
7.分析的时候需要的是单个的细胞，400目筛网过滤是用来将粘在一起的细胞团滤掉，否则会出现人为的多倍体干扰，不过如果经验丰富的操作人员也可以gate掉。如果没有条件过滤，请在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色。
8.本试剂盒也可用于非固定细胞周期检测。
9.组织处理方法：用剪刀将组织剪成小块，用0.25%胰酶消化30min－1h，200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
1. 染色工作液的配制：
根据样本数量，用37℃培养箱预热的PBS将BBcellProbe® NucGreen L1荧光染料500倍稀释，配制成染色工作液。
2. 收集样本细胞，细胞数量在5-10X106个。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次。
4. 在15ml离心管中，用500 μl PBS重悬细胞。
5. 滴加2-5ml冷乙醇4℃固定过夜或-20℃固定1小时。
6. 取5X106细胞，在15ml锥形离心管中1000×g离心10分钟，弃上清，收集细胞。
7. 用冷PBS洗涤细胞两次。
8. 用500 μl冷PBS重悬细胞。
9. 加入Rnase A溶液20 μl， 37℃水浴30分钟。
10. 用400目细胞筛网过滤。
11. 在1000×g离心10分钟，弃上清，收集细胞。
12. 加入500 μl NucGreen染液重悬细胞，轻轻混匀后4℃避光孵育30分钟-2小时。
13. 流式检测结果。激发波长为488nm。发射波长526nm。
采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
固定细胞可能难以离心沉淀；固定细胞可能成团；固定细胞膜容易损伤成碎片。操作过程中注意以上几点。
2.可以不固定细胞吗？
本试剂盒可以用于非固定细胞的周期检测。
lnc9141-a and -b Play a Different Role in Bovine Myoblast Proliferation, Apoptosis, and Differentiation
Molecular Therapy-Nucleic Acids 2019 （IF=5.919）
2.Jiebing Yang, et al.
Phenylboronic acid-modified polyamidoamine-mediated delivery of short GC rich DNA for hepatocarcinoma gene therapy
Biomaterials science 2019 （IF=5.831）
3.Wenqi Chen, et al.
Chondroitin sulfate-functionalized polyamidoamine as a tumor-targeted carrier for miR-34a delivery
Acta Biomaterialia 2017 （IF=6.383）
4.Feng Liu, et al.
Interleukin-6-stimulated progranulin expression contributes to the malignancy of hepatocellular carcinoma cells by activating mTOR signaling
Sci Rep. 2016; 6: 21260 （IF 5.228）
5.Fei Fei, et al.
The number of polyploid giant cancer cells and epithelial-mesenchymal transition-related proteins are associated with invasion and metastasis in human breast cancer
Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 2015 （IF 6.217）
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