-20℃保存。

1. 染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
2. 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4. 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

细菌

1. 荧光酶标仪/荧光光度计/激光共聚焦/流式细胞仪/荧光显微镜等
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒

1. 0.85% NaCl溶液

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套

1. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3. 试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
4. 建议收到产品后，根据单次使用量，对CYTO 9母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
5. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
6. 所有染色操作在塑料容器进行，不要在玻璃容器染色。
7. 以下为进行活死细菌染色观察的参考步骤，可以根据文献的方法进行调整。如果有必要，也可以设定对照活细菌和死细菌，进行定量检测。可以参考附录中的对照细胞设定方法，也可以根据需要自己设定对照和检测方法。
8. 标记的条件因细菌种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细菌类型、细菌的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
9. 流式检测时建议添加直径6.0 µm微球标准品。
10. 细菌类型会明显影响红色荧光的量。


关于细菌死/活的定义标准：
11. 需要注意任何单一指标判断细菌死活的局限性。就单个细菌样本的生理状态而言，并不容易定义生存能力或形态参数，因此进行单个指标的生存力测定可能会在实验中引入特定的偏见。
12. 本试剂盒的这种LIVE /DEAD细菌膜通透性染色测定与在合适的液体或固体营养培养基中进行生长分析的其它细菌生存力的标准一般需要结合分析。 在某些情况下，细菌膜受损可能会恢复和繁殖，即使此类细菌在本试剂盒分析中可能被评为“死亡”。相反，某些具有完整膜的细菌可能无法在营养培养基中繁殖，但在本试剂盒分析中被评为“活”。
13. 几种不同的生存能力衡量指标，例如膜渗透性，酶活性和氧化还原电位需要综合分析评判，才可能提供更多彻底评估细菌生存力并消除固有的任何单一生存力测定法的局限性。


关于染色条件的优化：
14. 不同的细菌类型会明显影响荧光的量。
15. 建议的染色条件染色以下细菌类型显示出良好的相关性，其它细菌类型请在以下范围或超过以下浓度范围内测试最佳染色条件：Bacillus cereus, B. subtilis, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Mycobacterium phlei, Pseudomonas aeruginosa, P. syringae, Salmonella oranienburg, Serratia marcescens, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus，Streptococcus pyogenes，Agrobacterium tumefaciens, Edwardsiella ictaluri, Eurioplasma eurilytica, Lactobacillus sp., Mycoplasma hominus, Propionibacterium sp.,Proteus mirabilis and Zymomonas sp.。
16. 标记的条件因细菌种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细菌类型、细菌的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。

染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用37℃培养箱预热0.85% NaCl溶液将BBcellProbe® CYTO 9荧光染料进行500倍稀释，将PI进行100-500倍稀释，配制成染色工作液。
例如：
每10ml 0.85% NaCl溶液中加入20 μl染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10ml 0.85% NaCl溶液中加入20-100 μl染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。

细菌染色：
1. 收集样本细菌，用0.85% NaCl溶液洗涤细胞3次。
2. 用100 μl-200 μl染色工作液将细菌重悬。
3. 在室温避光孵育15分钟。
4. 用0.85% NaCl溶液洗涤细菌一次。
5. 用适量0.85% NaCl溶液重悬细菌。
6. 将5 μl菌液滴加到载玻片，盖上盖玻片，油镜观察。
7. 用荧光显微镜观察。激发波长为488 nm，最大发射波长为500 nm和635 nm。

结果分析 ：
可以在Ex / Em = 488 / 500 nm（FITC滤光器组）和540 / 635 nm（TRITC滤光器组）下荧光测量染色细胞，分别用于活细菌和死细菌。
荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细菌为黄绿色，死细菌为红色。
用545 nm波长激发，仅能够看到红色的死细菌。

1. Liang Ren, et al.
Construction of high selectivity and antifouling nanofiltration membrane via incorporating macrocyclic molecules into active layer
Journal of Membrane Science 2020 （IF=7.015）

2. Xinxin Zhang, et al.
Characterization and property of dual-functional Zn-incorporated TiO2 micro-arc oxidation coatings: The influence of current density
Journal of Alloys and Compounds 2019 （IF=4.175）

3. Jie Zhu, et al.
Functional Synergy Of Antimicrobial Peptides And Chlorhexidine Acetate Against Gram-Negative/Gram-Positive Bacteria And A Fungus In Vitro And In Vivo
Infection and Drug Resistance 2019 （IF=3.443）

4. Xinxin Zhang, et al.
Characterization and property of bifunctional Zn-incorporated TiO2 micro-arc oxidation coatings: The influence of different Zn sources
Ceramics International 2019 （IF=3.45）