2-8℃避光

1. 微量试剂须融解离心再开盖！
2. 开盖后组份按要求条件保存。
3. 拆封后请尽快使用完！

6个月

荧光酶标仪或荧光光度计

细胞裂解/组织匀浆液/纯化的重组酶

1. 荧光酶标仪/荧光分光光度计
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒

1. PBS缓冲液
2. 蛋白定量试剂盒

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 荧光检测专用的黑色96孔板（必备）

1. 除了目标模型样本，须根据实验需要合理设置阳性对照、阴性对照、空白对照等样本。
2. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
3. 底物为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4. 预实验需确定酶浓度和孵育时间的线性区间，避免底物过度消耗或信号饱和。
5. 37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。
6. 如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500 μg每样。
7. 如果样品中激活的PKA水平很低，适当调节诱导细胞的时间，找一个PKA激活比较强的时间点进行检测。
8. 底物避光保存，使用过程中尽量避光。
9. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
10. 荧光酶标仪检测必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。由于该底物的激发波长在紫外区，普通透明孔板会产生较高的背景信号。使用黑色96 孔板进行检测，显著降低背景干扰。
11. PKA的特异性抑制剂可以添加作为阴性对照。
12. 待测样品避免带入大量DMSO（超过 1%）。

电子版说明书仅供参考，最终以试剂盒里的纸质说明书为准！

确认下设备是否满足条件：激发波长（Ex）= 295 nm，发射波长（Em）= 350 nm。


样品处理
A． 细胞样品
1. 收集5×106个以上的细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50 μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置冰上持续振荡20-45分钟。
5. 在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上保存备用。

B． 组织样品
1. 取适量组织样本剪碎，按照每50 mg/100 μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，冰上振荡20-45分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
2. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
3. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。


蛋白定量
对上述处理过的上清进行蛋白定量。


PKA活性检测

1. 每孔加入50 μl检测缓冲液、10 μl荧光底物、2 μl反应启动液D、1 μl反应启动液E。充分混匀。
2. 再加入 40 μl裂解上清（含100-200 μg蛋白），充分混匀.
3. 立即放入预热的酶标仪检测，在37℃下检测30分钟-1小时。
4. 荧光酶标仪检测荧光强度。
激发波长（Ex）= 295 nm，发射波长（Em）= 350 nm。
5. 根据待测细胞的荧光值与对照细胞样本的荧光值的比值计算相对的PKA 活性程度变化。


酶活性计算
蛋白激酶A 活性可表示为每百万细胞的相对荧光单位（RFU）、样品中每微克蛋白质的相对荧光单位（RFU），或处理组样品相对于未处理对照组或阴性对照样品的 RFU 倍数增加。

酶活性 = F / C样本