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保存温度
-20℃避光
注意事项
开盖后组份按要求条件保存。
有效期
6个月
检测方法
荧光酶标仪或荧光光度计
适用样本
细胞/组织/纯化的重组酶
仪器准备
1. 荧光酶标仪/荧光分光光度计
2. 离心机
3. 恒温水浴/气浴/金属浴设备
4. 移液器
5. 冰箱
2. 离心机
3. 恒温水浴/气浴/金属浴设备
4. 移液器
5. 冰箱
试剂准备
1. PBS缓冲液
2. 蛋白定量试剂盒
3. （选做）特异性抑制剂
2. 蛋白定量试剂盒
3. （选做）特异性抑制剂
耗材准备
1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 荧光检测专用的黑色96孔板（必备）
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 荧光检测专用的黑色96孔板（必备）
使用注意事项
1. 底物为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
2. 预实验需确定酶浓度和孵育时间的线性区间，避免底物过度消耗或信号饱和。
3. 如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500 μg每样。
4. 如果样品中激活的TACE水平很低，适当调节诱导细胞的时间，找一个TACE激活比较强的时间点进行检测。
5. 底物避光保存，使用过程中尽量避光。
6. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
7. 荧光酶标仪检测必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。由于该底物的激发波长在紫外区，普通透明孔板会产生较高的背景信号。使用黑色96 孔板进行检测，显著降低背景干扰。
8. 酶标仪检测一般选顶读模式，建议分别测试下顶读和底读模式，选择相应仪器和耗材适应的灵敏度高的模式。注意调整Z轴高度。调大增益值。避免气泡干扰。
9. TACE的特异性抑制剂可以添加作为对照。
10. 待测样品避免带入大量DMSO（超过 1%）。
11. 全程冰上操作，避免酶失活。
12. 组织匀浆和细胞破碎时避免过热（<4℃）。
13. 重组蛋白浓度过高可能导致底物耗尽，建议预实验确定最佳稀释倍数。
14. 液体酶样品的话pH值必须在该酶的适合pH附近， 过高或过低偏离太大会导致酶活性显著下降。
15. 样本应避免反复冻融，最好新鲜制备后立即检测；若需保存，应分装后 - 80°C 保存，且保存时间不超过 1 周。
2. 预实验需确定酶浓度和孵育时间的线性区间，避免底物过度消耗或信号饱和。
3. 如果样品中蛋白含量低，加大样品量，裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500 μg每样。
4. 如果样品中激活的TACE水平很低，适当调节诱导细胞的时间，找一个TACE激活比较强的时间点进行检测。
5. 底物避光保存，使用过程中尽量避光。
6. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
7. 荧光酶标仪检测必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。由于该底物的激发波长在紫外区，普通透明孔板会产生较高的背景信号。使用黑色96 孔板进行检测，显著降低背景干扰。
8. 酶标仪检测一般选顶读模式，建议分别测试下顶读和底读模式，选择相应仪器和耗材适应的灵敏度高的模式。注意调整Z轴高度。调大增益值。避免气泡干扰。
9. TACE的特异性抑制剂可以添加作为对照。
10. 待测样品避免带入大量DMSO（超过 1%）。
11. 全程冰上操作，避免酶失活。
12. 组织匀浆和细胞破碎时避免过热（<4℃）。
13. 重组蛋白浓度过高可能导致底物耗尽，建议预实验确定最佳稀释倍数。
14. 液体酶样品的话pH值必须在该酶的适合pH附近， 过高或过低偏离太大会导致酶活性显著下降。
15. 样本应避免反复冻融，最好新鲜制备后立即检测；若需保存，应分装后 - 80°C 保存，且保存时间不超过 1 周。
使用方法
电子版说明书仅供参考，最终以试剂盒的纸质说明书为准！
样品处理
液体样品：
直接测定。
细胞样品：
1. 收集5×106个以上的细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50 μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置冰上持续振荡20-45分钟。
5. 在4℃，12,000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，用 BCA 法测定蛋白浓度。
7. 置于冰上立即检测或者-80℃冰箱保存备用。
组织样品：
1. 取适量组织样本剪碎，预冷的 PBS 冲洗去除残留血液，无菌滤纸吸干表面液体，快速称重后剪碎。
2. 按照每50 mg/100 μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见组织块。
3. 冰上振荡20-45分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
4. 在4℃，12,000×g条件下离心5分钟。
5. 将中层上清液吸入另一预冷的干净离心管。
6. 用 BCA 法测定蛋白浓度。
7. 置于冰上立即检测或-80℃冰箱保存备用。
【注】：
避免反复冻融。
反复冻融会导致蛋白活性不可逆下降。
蛋白定量
对上述处理过的上清进行蛋白定量。
酶活性计算
肿瘤坏死因子α转换酶 活性可表示为每百万细胞的相对荧光单位（RFU）、样品中每微克蛋白质的相对荧光单位（RFU），或处理组样品相对于未处理对照组或阴性对照样品的 RFU 倍数增加。
酶活性 = F / C样本
F：荧光强度（RFU）
C样本：样本蛋白浓度，mg/ml；
样品处理
液体样品：
直接测定。
细胞样品：
1. 收集5×106个以上的细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 在细胞中加入50 μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4. 置冰上持续振荡20-45分钟。
5. 在4℃，12,000×g条件下离心15分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，用 BCA 法测定蛋白浓度。
7. 置于冰上立即检测或者-80℃冰箱保存备用。
组织样品：
1. 取适量组织样本剪碎，预冷的 PBS 冲洗去除残留血液，无菌滤纸吸干表面液体，快速称重后剪碎。
2. 按照每50 mg/100 μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见组织块。
3. 冰上振荡20-45分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
4. 在4℃，12,000×g条件下离心5分钟。
5. 将中层上清液吸入另一预冷的干净离心管。
6. 用 BCA 法测定蛋白浓度。
7. 置于冰上立即检测或-80℃冰箱保存备用。
【注】：
避免反复冻融。
反复冻融会导致蛋白活性不可逆下降。
蛋白定量
对上述处理过的上清进行蛋白定量。
酶活性计算
肿瘤坏死因子α转换酶 活性可表示为每百万细胞的相对荧光单位（RFU）、样品中每微克蛋白质的相对荧光单位（RFU），或处理组样品相对于未处理对照组或阴性对照样品的 RFU 倍数增加。
酶活性 = F / C样本
F：荧光强度（RFU）
C样本：样本蛋白浓度，mg/ml；
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