3D胶原蛋白培养试剂盒/细胞培养三维胶原蛋白试剂盒(5mg/ml,无菌)

BB-48711
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  • 10ml
价格
  • ¥4600元
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产品概述 product description

细胞迁移是正常细胞过程(包括细胞增殖和迁移)的基本功能。 通常在2D环境中检查体外细胞行为。然而,在体内,细胞存在于富含I型胶原的三维细胞外基质环境中。 实际上,与传统的2D系统相比,在3D基质中培养的细胞可以更好地反映体内细胞生理。
贝博® 3D细胞培养三维胶原蛋白培养试剂盒(3D胶原蛋白培养试剂盒)是采用贝博开发的胶原三维细胞培养系统。该系统紧密模拟正常组织富含胶原蛋白的细胞外基质。该3D系统提供了一种简单快速的方法来分析3D胶原基质中的细胞血管生成,迁移,凋亡,增殖和组织形成。 混悬在该3D系统中的细胞可以通过相对比或荧光显微镜检查轻松可视化。 细胞可以直接固定并在基质内染色,并用抗体处理以可视化特定的细胞内和细胞外蛋白。 重要的是,混悬在贝博3D系统中的细胞也可以用各种试剂处理,从而可以广泛筛选对生长因子和化学试剂的生物学反应。
细胞外基质对细胞的发育和行为有极大的影响。I 型胶原作为细胞外基质的主要组成成分,常用于原代细胞培养。Ⅰ型胶原存在于大多数组织和器官中,是结缔组织和内脏器官细胞外基质的主要构造成分,在皮肤、肌腱、骨骼中分布最为广泛。Ⅰ型胶原是由2条α1链和1条α2 链组成的长约300 nm的异源三聚体[α1( I )2 α2( I )]。位于细胞表面的胶原结合受体包括四大类,分别是整合素受体(α1β1, α2β1, α10β1, α11β1),盘状结构受体(Discoidin domain receptors,DDRs),主要位于血小板上的 Glycoprotein VI 受体以及位于免疫细胞上的 LAIR-1 受体。细胞可以通过以上受体与三聚体形态的 I 型胶原结合,从而调节细胞的粘附、形态、生长、迁移和分化。
贝博胶原蛋白I 是根据Birkedal-Hansen 方法,通过醋酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备。可用于三维胶的制备,模拟真实的生长环境,使得细胞在三维环境中生长。还可用于包被细胞培养器皿,培养细胞表面粘附性,特别适合那些在普通培养器皿表面不易贴壁的细胞,比如成纤维细胞、肝细胞等原代细胞。本胶原蛋白在中性pH 下自发形成三螺旋骨架,是一种优秀的细胞培养用基质。
本试剂盒可以用于肝细胞、成纤维细胞、脊神经节、肌肉细胞、施万细胞、胚肺细胞、上皮细胞和其他大量细胞系。可用于研究肿瘤细胞的侵袭和迁移、多能干细胞介导的肝细胞形成,神经细胞培养和移植,原代干细胞的体外培养及表型和功能的维持,体外类器官的三维培养,肿瘤球体(spheroids)形成及培养等多个生物学过程。
本试剂盒中胶原液溶于6 mM 醋酸盐缓冲液的无菌溶液,浓度5 mg/ml,每个批次产品皆通过细胞培养测试(包括三维空间培养)以保证质量的可靠性。批间差异小,内毒素严格控制,无免疫原性,可用于各种细胞的体外三维培养及体内移植。
胶原液形态为透明至乳白色液体,纯度≥99%,通过SDS-PAGE检测,pH值范围2-4,内毒素<0.5 EU/ml。

保存温度
2-8℃
注意事项
1. 避免冷冻!
2. 试剂拆封后请尽快使用完!
3. 使用前请按照以下比例添加丙酮酸钠,碳酸氢钠和谷氨酰胺至5×MEM 培养基。现配现用,否则会有结晶析出。
取5×MEM 培养基2.5mL,添加丙酮酸钠溶液0.0275mL,使其终浓度为0.55 g/L;添加碳酸氢钠溶液0.367mL,使其终浓度为11g/L;添加谷氨酰胺溶液0.125 mL,使其终浓度为1.46 g/L。
有效期
一年
适用样本
细胞
仪器准备
1. 离心机
2. 培养箱
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒
试剂准备
1. PBS缓冲液
2. 培养基
耗材准备
1. 无菌离心管
2. 无菌吸头
3. 无菌注射器
4. 一次性手套
5. 细胞培养耗材
使用注意事项
1. 预实验很重要。必须要做预实验,在正式实验之前取少量样本优化实验条件,并像正式样本一样认真进行,看实验结果是否可行,实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性,不同样本的实验条件通常差异较大,同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同,为了避免浪费正式样本和试剂,一定要提前预实验优化实验条件。
2. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
3. 胶原原液不能冷冻,冷冻后再解冻会产生蛋白变性及蛋白沉淀。
4. 高浓度的胶原原液是粘稠状的,使用时应该一直放置在冰上。
5. 混合物在红色至粉红色之间,说明其为生理 pH,可形成凝胶。
6. 配制混合物的整个过程必须在冰上保持低温。
7. 当胶原原液出现浑浊不透明时,可能被污染,不能使用。
8. 胶原能在培养瓶/皿上作为薄层包被或凝胶化用于细胞附着。细胞可以培养在凝胶上或凝胶内。以下以含细胞三维胶原制备为例。也可以先不加细胞,制备好三维胶原凝胶培养器皿后,再添加细胞悬液进行培养。
9. 离心机转速有相对离心力(RCF,×g)和每分钟转速(RPM,r/min)两种表示方式,有些离心机设置有RPM和×g显示切换,但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算:
g=r×1.118×10-5×rpm2 (r 为有效离心半径,即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度,单位为厘米) 例如: 转速为3000 rpm,有效离心半径为10 cm,则相对离心力(RCF,×g)为=10×1.118×10-5×30002=1006.2(×g)。
使用方法
三维胶原的制备:
一、 不含细胞的三维胶原
1. 根据下表计算一定体积胶原凝胶所需各成分添加的量。
总体积(mL) 胶原(mL) 5×MEM(mL) NaOH中和液(uL)
1 0.8 0.2 6 μl起适量
5 4 1 30 μl起适量
10 8 2 60 μl起适量

2. 准备碎冰置于冰盒中,接下来的混匀步骤需将混合管插入冰中。取预冷的50 mL 无菌管,插入冰中,使用无菌注射器移取适量体积的胶原原液到该无菌管中。加入对应体积的5×MEM 培养基,用注射器反复抽吸至少20 次。
3. 将以上胶原/培养基混合液移入另一含有中和液的预冷的无菌离心管,用注射器反复抽吸至少20 次,并再次少量添加中和液并充分混匀,至混合物变成红色为止。抽吸过程中应确保无菌管插在冰中。
4. 抽吸结束后,会看到混合物中有很多气泡。将无菌管放入离心机,3000 rpm,2-8℃快速离心15 s 排出气泡后取出,插入冰上。
5. 三种成分添加好后立即充分混匀,混匀后立即加到培养器皿中。
6. 将培养器皿在室温(25℃左右)放置20 min后,转移到培养箱内。
7. 在37℃孵育1 h即可在细胞培养器皿底部形成胶原凝胶。
8. 将需要培养的细胞悬液加入胶原凝胶上,正常培养。


二、 含细胞三维胶原
1. 将预培养的细胞收集到离心管中,使用 1×MEM 培养基进行重悬,其体积不应超过预使用的胶原凝胶体积的 1/10。
2. 根据下表计算一定体积胶原凝胶所需各成分添加的量。
3. 准备碎冰置于冰盒中,接下来的混匀步骤需将无菌混合管插入冰中。
4. 取预冷的无菌离心管,插入冰浴中,使用预冷的无菌注射器移取适量体积的胶原原液到该无菌管中。
5. 接下来,加入对应体积的 5×MEM 培养基,充分混匀,加入到另一含有中和液的冰浴离心管中,用注射器反复抽吸20-25次,并再次少量添加中和液并充分混匀,至混合物变成红色为止。抽吸过程中应确保无菌管插入冰中。
6. 抽吸结束后,会看到混合物中有很多气泡。将无菌管放入离心机,3000 rpm,2-8℃快速离心15 s后取出,插入冰上,5 min内需完成与细胞混合加入培养皿中。
7. 将细胞混入胶原混合物当中,用移液器缓慢抽吸进行混合。
8. 加入细胞培养器皿,37℃孵育1 h即可在细胞培养器皿底部形成胶原凝胶。
9. 加入相应的细胞培养基到胶原凝胶上,正常培养。
常见问题分析
1. 3D细胞培养后如何染色?
3D细胞培养后可以直接在胶中进行染色,染色步骤同2D培养的细胞。不需要进行特殊处理。

2. 你们的3D培养凝胶试剂盒是不是只能培养特定的一些细胞?
本试剂盒对细胞没有选择性,对大多数细胞都是适用的。

3. 你们的3D培养凝胶试剂盒和Matrigel基质胶有何不同?
Matrigel基质胶主要是由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成,是从肿瘤中提取出来的,成分复杂。本试剂盒为单一胶原成分。用Matrigel基质胶进行3D培养,其后期染色非常困难,使用本试剂盒进行3D培养后的细胞可以轻松染色。

4. 凝胶和细胞悬液混合这一步,是否有顺序要求?
有。必须严格按照说明书,顺序不可颠倒。否则不利于形成稳定的凝胶结构。

5. 使用中如何吸取胶原?
先将吸头尖剪掉,用 PBS 润洗,然后再吸取凝胶。慢慢松开移液枪的按钮,按钮弹回原位之后,让枪头在凝胶液面以下稍多停留一会儿,再提枪,转移凝胶到其他容器中。

6. 何时添加培养基?
37 ℃恒温培养箱中孵育 5-30 min 形成稳定3D凝胶结构后即需要添加培养液。将培养液贴壁缓慢加入孔板中。

7. 长期培养需要如何换液?
换液时,弃掉2/3 左右的旧培养基即可,留少量旧液以避免吸走凝胶;生长快的细胞,24 h 时可以换掉一半培养液。换液时一定要紧贴培养孔壁,小心缓慢吸取旧液,避免吸掉刚贴附好的细胞。添加新液一定要贴壁、缓慢加入,以避免冲坏凝胶。此后可根据细胞生长速度,视培养液的消耗情况来换液。

8. 3D细胞培养后怎么观察?
3D细胞培养后可以使用Confocal或者荧光倒置显微镜进行观察,光学显微镜也可以观察,但是由于凝胶是立体结构,可能光学显微镜观察的效果不会太理想。

9. 你们的3D细胞培养凝胶能进行长期培养吗?
可以。

10. 你们的3D细胞培养凝胶使用时需要使用配套的耗材或者仪器吗?
不需要使用特殊耗材和仪器。采用本试剂盒进行3D细胞培养时所用的耗材和仪器同2D培养。

11. 你们的3D细胞培养凝胶试剂盒可以用于细胞共培养吗?
可以进行细胞共培养。