2-8℃ 避光

开盖后组份按要求条件保存。

6个月

分光光度计

血清血浆/组织/细胞

1.快速：整个操作过程约50分钟。
2.取样量极微：本法取手指或耳垂等末稍血20μl-50μl即可测红细胞中的SOD，只需2ml静脉血可测白细胞中的SOD及血小板中SOD，只需6mg组织就可测组织血浆、胞浆、0.2g组织可测线粒体及微粒中的SOD。
3.灵敏度高：ID50=0.05g/ml是邻苯三酚法灵敏度的18倍，因而可测定心肌灌流液、脑脊液、胸腹水、肾透析液、心肌培养细胞、肿瘤培养细胞中的SOD，此法最灵敏。
4.稳定性好：试剂放在0℃-4℃冰箱中可保存6个月。取混合血清放在4℃冰箱中，三天内SOD活力不变。
5.再现性好：变异系数CV=1.7%，同一份标本这次测得结果与几天后测得结果相差无几。
6.受外界影响因素小，优于其它各种化学检测法，优于放免法。
7.测试面广：即可测T-SOD又可测得Mn-SOD也可测得CuZn-SOD，本法测试各种动物红细胞、白细胞、血小板、血清（浆）、心肌组织、肺、肝、肾、脾、耳膜、肾上腺等几十种组织匀浆、线粒体、微粒体、离体心肌灌流液、肾透析液、腹水、胸水、脑脊液、心肌培养细胞、肿瘤培养细胞等，效果均很佳。
8.不需要昂贵或特殊的仪器，只需恒温水浴箱与721、722、751、752等可见分光光度计。用简单的仪器测出高水平的指标。

分光光度计

1.分光光度计（酶标仪）
2.恒温水浴锅
3.离心机
4.移液器
5.冰盒

1.PBS
2.冰醋酸
3.纯水

1.试管
2.吸头

1.试管要洗干净，在测微量样品时，例如心肌培养细胞、肿瘤培养细胞、白细胞、血小板、线粒体、微粒体或离体心肌灌流液等尤为重要。
2.所有试剂的配制均应在测试前一天进行，目的使其充分溶解。配好后的试剂，4℃可以保存3-6个月，测试前从冷藏箱中拿出的试剂及样品要在室温中放30分钟后再用。
3.为避免测试误差，第一次吸的试剂要丢掉，用作冲洗管道，吸嘴外周若挂有液体要用滤纸轻轻擦干，样品和试剂要垂直加入试管，不要加在管壁上(因试剂及样品量小)。水浴前要用旋涡混匀器充分混匀。
4.每次水浴时间为40分钟，（当室温低于20℃时水浴时间适当延长至45分钟）水浴温度37℃要固定。
5.对照管要做2支，并且放在所有测试管的中间做，取其平均值。或每9支测定管做一支对照管。
6.同一份标本测总SOD与Mn-SOD或者是测总SOD与CuZn-SOD时，只需测其中一对即可以。因为总SOD减去Mn-SOD等于CuZn-SOD；总SOD减去CuZn-SOD等于Mn-SOD。
7.测试前先预试以确定最佳取样量：当您第一次使用本试剂盒测试某一种新的组织样品时最好先做三只不同取样量的测试管。例如想测1%脑组织匀浆，取样量分别为10μl、30μl、50μl，然后计算结果应在0.15-0.55之间，即百分抑制率在15-55%之间，然后取百分抑制率在45%或48%左右的一管作为最佳取样量，因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时，则需将样本浓度稀释或减少上样量再测试。若百分抑制率小于20%时，则需将样品量加大后再测试。
8.本试剂盒亦可用酶标仪读数（可在反应完后取200ul加进96孔板，于550nm处读数，计算时所有OD值减去空白板OD值代入公式计算即可）

试剂配制
1. 试剂A：
试剂A工作液的配制：用时每瓶5ml储备液加蒸馏水稀释至50ml，4℃保存一年。
2. 试剂D：贮备液 -20℃保存。
用时和试剂D稀释液按1：14稀释，即为试剂D工作液，最好现配现用。
配好的试剂D工作液2-8℃保存，不可冷冻。
3. 试剂E：
用时加70℃-80℃双蒸水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补水至37.5ml，配好后的试剂避光4℃冷藏6个月。
4. 试剂F：
用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后试剂避光4℃冷藏6个月。
5. 显色剂的配制：按照试剂E：试剂F：冰乙酸=3：3：2的体积比配成显色剂，最好现配现用。配好后显色剂4℃避光冷藏3个月。
样本处理：
1. 组织匀浆的制备：
准确称取组织重量，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例，加入9倍体积的匀浆介质（推荐0.86%或0.9%的生理盐水），冰浴，机械匀浆，制备成10%的匀浆液，2500-3000转/分，离心10min，取上清待测。
取得的上清液根据不同组织，再用匀浆介质稀释成不同浓度，进行最佳取样量的摸索，确定好最佳取样量后按下表进行正式实验。

2. 植物组织的前处理：
准确称取植物组织重量，按重量（g）：体积（ml）=1:4的比例，加入4倍体积的匀浆介质（推荐0.1mol/L pH7.0-7.4磷酸盐缓冲液），冰浴，机械匀浆制备成20%的匀浆液，3500-4000转/分，离心10min，取上清待测。
取得的上清液根据不同组织，再用匀浆介质稀释成不同浓度，进行最佳取样量的摸索，确定好最佳取样量后按下表进行正式实验.

3. 高脂血症血清（浆）样本的前处理：
轻度高脂血症：外观略有混浊，血清测试前只需加等量的生理盐水稀释即可；
中度高脂血症：外观混浊较明显，血清测试前需加等量的生理盐水稀释，再加血清1/2量的无水乙醇混匀即可；
重度高脂血症：取50ul高脂血清（浆）加生理盐水200ul混匀后，加无水乙醇150ul充分混匀1min，再加入三氯甲烷150ul，充分混匀1min，3500转/分，离心10min，取上清待测

4. 红细胞抽提液的制作：
① 采集新鲜血或肝素抗凝的静脉血或动脉血50ul，加入盛有1-2ml生理盐水的带刻度的离心管中，500-1000转/分，离心10min；
② 用移液器也可用针筒接上麻醉针头吸去上清液（吸净），留沉淀的红细胞；
③ 在红细胞中加入冷双蒸水0.2ml，混匀（使红细胞充分溶解，将溶血液对光观察看是否呈现透明状，则表示充分溶解）；
④ 加入95%乙醇0.1ml，振荡30秒；
⑤ 加入三氯甲烷0.1ml置漩涡混匀器充分抽提混匀1min；
⑥ 3500转/分离心8min。此时液体分三层：上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷。若上清有混浊可加入少量固体NaCl后再离心5min，即可澄清。记录上清液体积，取5-20ul进行最佳取样量的摸索。（剩余的红细胞抽提液可放冰箱冷冻备用）

结果计算：
（一）血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD活力计算：
1. SOD活性单位定义：
每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

2. 总SOD活力计算公式：
（1）血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD活力计算公式：
SOD活力（U/ml）=（对照吸光度-测定吸光度）÷对照管吸光度÷50%×反应体系稀释倍数×样品测试前稀释倍数

（2）高脂血症血清（浆）中总SOD活力计算公式：
SOD活力（U/ml）=（对照吸光度-测定吸光度）÷对照管吸光度÷50%×反应体系稀释倍数×样品测试前稀释倍数

反应体系稀释倍数= 反应液总量 = 试剂量 3.3ml + 反应体系中的取样量
取样量 反应体系中的取样量

重度高脂血症血清（浆）= 取样量50ul+生理盐水200ul+无水乙醇150ul=400ul
测试前的稀释倍数 取样量50ul 50ul


（二）组织匀浆中SOD活力计算：
1. SOD活性单位定义：
每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

2. 计算公式：
SOD活力（U/mgprot）=（对照管吸光度-测定管吸光度）÷对照管吸光度÷50%×（反应液总体积÷取样量ml）÷样品中蛋白浓度（mgprot/ml）


（三）红细胞中总SOD活力计算：
1. SOD活性单位定义：
每克血红蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

2. 红细胞中总SOD活力计算公式：
SOD活力（U/gHb）=（对照吸光度-测定吸光度）÷对照管吸光度÷50%×反应液体积×（抽提液总量÷测定抽提液量）x（1ml÷采血量）÷血红蛋白含量（gHb/ml）