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2-8℃
注意事项
试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
6个月
适用样本
植物
仪器准备
1. 光学显微镜
2. 激光共聚焦（可选）
2. 激光共聚焦（可选）
试剂准备
1. 系列乙醇
2. 2.5% 戊二醛（可选）
3. 二甲苯或叔丁醇透明
4. 中性树胶
2. 2.5% 戊二醛（可选）
3. 二甲苯或叔丁醇透明
4. 中性树胶
耗材准备
一次性手套
使用注意事项
1. 试剂开封后应尽快使用，以免影响后续实验效果。
2. 染色时间优化：过短导致信号弱，过长引起背景高。建议预实验确定最佳时间（如叶片表皮10分钟，果实组织20分钟）。
3. 避免金属干扰：钌红可能与Ca²⁺、Mg²⁺结合，若研究离子对果胶的影响，需用去离子水配制溶液。
4. 活体染色限制：未固定样品染色后需立即观察，长期保存需固定和脱水处理。
5. 对照实验：阴性对照：用不含钌红的缓冲液处理，排除自发荧光或杂质干扰。
6. 竞争性抑制：加入过量果胶甲酯酶（PME）预处理，验证染色特异性。
2. 染色时间优化：过短导致信号弱，过长引起背景高。建议预实验确定最佳时间（如叶片表皮10分钟，果实组织20分钟）。
3. 避免金属干扰：钌红可能与Ca²⁺、Mg²⁺结合，若研究离子对果胶的影响，需用去离子水配制溶液。
4. 活体染色限制：未固定样品染色后需立即观察，长期保存需固定和脱水处理。
5. 对照实验：阴性对照：用不含钌红的缓冲液处理，排除自发荧光或杂质干扰。
6. 竞争性抑制：加入过量果胶甲酯酶（PME）预处理，验证染色特异性。
使用方法
样本前处理：
植物材料：新鲜植物组织（如根尖、叶片、果实等），切成薄片（厚度≤2 mm）或撕取表皮。
固定（可选）：
使用 2.5% 戊二醛（溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.2） 固定2-4小时（4℃）。
若观察活体果胶动态，可跳过固定直接染色。
染色液配制：
0.05%-0.1% 钌红水溶液（或溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 6.8）。
染色步骤：
1. 将样品浸入染色液中，室温避光孵育10-30分钟（时间根据组织厚度调整）。
2. 轻柔摇动避免沉淀附着。
3. 洗涤，去除多余染料：用蒸馏水或磷酸缓冲液（pH 6.8）漂洗3次，每次5分钟，至洗液无色。
关键：充分洗涤减少背景染色。
4. 脱水与封片（针对永久制片）
梯度脱水（仅固定样品需要）：
依次通过30%、50%、70%、85%、95%、100%乙醇，每级10分钟。
透明：二甲苯或叔丁醇透明10分钟。
封片：中性树胶封片，避免气泡。
5. 显微镜观察
光学显微镜：
果胶区域呈红色至紫红色，中胶层和细胞角隅处染色最深。
使用明场观察，无需荧光激发。
共聚焦显微镜（可选）：
若结合其他荧光染料（如Calcofluor White标记纤维素），需调整通道避免串色。
植物材料：新鲜植物组织（如根尖、叶片、果实等），切成薄片（厚度≤2 mm）或撕取表皮。
固定（可选）：
使用 2.5% 戊二醛（溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.2） 固定2-4小时（4℃）。
若观察活体果胶动态，可跳过固定直接染色。
染色液配制：
0.05%-0.1% 钌红水溶液（或溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 6.8）。
染色步骤：
1. 将样品浸入染色液中，室温避光孵育10-30分钟（时间根据组织厚度调整）。
2. 轻柔摇动避免沉淀附着。
3. 洗涤，去除多余染料：用蒸馏水或磷酸缓冲液（pH 6.8）漂洗3次，每次5分钟，至洗液无色。
关键：充分洗涤减少背景染色。
4. 脱水与封片（针对永久制片）
梯度脱水（仅固定样品需要）：
依次通过30%、50%、70%、85%、95%、100%乙醇，每级10分钟。
透明：二甲苯或叔丁醇透明10分钟。
封片：中性树胶封片，避免气泡。
5. 显微镜观察
光学显微镜：
果胶区域呈红色至紫红色，中胶层和细胞角隅处染色最深。
使用明场观察，无需荧光激发。
共聚焦显微镜（可选）：
若结合其他荧光染料（如Calcofluor White标记纤维素），需调整通道避免串色。
常见问题分析
1.染色信号弱
钌红浓度过低或时间不足 提高浓度至0.1%，延长染色至30分钟
2.背景过高
洗涤不充分或染色时间过长 加强洗涤（增加次数或延长单次时间）
3.组织皱缩或破损
固定或脱水过程过激 降低乙醇梯度浓度或缩短脱水时间
4.染色不均匀
样品厚度不均或染色液沉淀 切薄片并过滤染色液，染色时轻微振荡
钌红浓度过低或时间不足 提高浓度至0.1%，延长染色至30分钟
2.背景过高
洗涤不充分或染色时间过长 加强洗涤（增加次数或延长单次时间）
3.组织皱缩或破损
固定或脱水过程过激 降低乙醇梯度浓度或缩短脱水时间
4.染色不均匀
样品厚度不均或染色液沉淀 切薄片并过滤染色液，染色时轻微振荡
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