-20℃避光

试剂拆封后尽快使用完

6个月

荧光显微镜 /激光共聚焦显微镜

细胞，组织切片

1.荧光显微镜 /激光共聚焦显微镜
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

1.PBS缓冲液；
2.纯水

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.载玻片和盖玻片

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
2.标本应新鲜，且未受其他化学物品污染。
3.应根据组织、细胞类型不同调整通透时间。
4.动物细胞样本细胞通透剂处理的时间很关键，如果处理时间太短，会造成很深的背景颜色，干扰细胞的观察:如果处理时间太长，会破坏细胞，造成细胞空洞。通透时间应控制在 10-35 分钟。需要根据预实验的染色结果确定最佳通透时间。一般预实验起始通透时间植物样本为 10 分钟，动物细胞样本5 分钟。
5.染色液染色时间根据根据预实验结果可以进行调整，颜色过浅可延长染色时间，颜色过深可缩短染色时间。

试剂配制:
1.Cathepsin B 免单抗配制:
根据样本数量，将 Cathepsin B 免单抗用 PBS 稀释 50 倍。
2.抗免 FITC 二抗
根据样本数量，将抗免 FITC 二抗用 PBS 稀释 50 倍。
3.核蓝色复染液
根据样本数量，用 PBS 稀释 50 倍。

贴壁细胞:
1.吸除培养液，用 PBS 洗涤1次。
2.加入固定液，固定 5-15 分钟。固定液的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常每孔加入 1ml 固定液。对于 96 孔板中的样品，通常每孔加入 100μ1固定液，其它多孔板的用量可以适当参考执行，后续以6孔板为例进行描述。
3.吸除固定液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5 分钟。
4.加入免疫染色封闭液，室温封闭10-20分钟。免疫染色封闭液的用量充分盖住样品即可对于6孔板中的样品，通常加入 1ml免疫染色封闭液。
5.吸除免疫染色封闭液，加入 Cathcpsin B 免单抗，室温孵育 1 小时或 4°℃ 孵育过夜。Cathepsin B免单抗的用量充分盖住样品即可，对于6孔板或 96 孔板中的样品，通常分别加入 1ml 或 50 μlCathepsin B 免单抗。
6.小心吸出 Cathepsin B 兔单抗到适当的容器内，4℃保存，留做下次使用。注:CathepsinB 免单抗通常至少可以重复使用5次。
7.洗涤液洗涤 3次，每次 5-10 分钟。
8.加入抗免 FITC 二抗，室温孵育1小时。抗免 FITC 二抗的用量充分盖住样品即可，对于6 孔板中的样品，通常加入 1ml 抗免 FITC 二抗。
9.小心吸出抗兔 FITC 二抗到适当的容器内，4°℃ 保存，留做下次使用。注:抗免 FITC二抗通常至少可以重复使用5 次。
10.洗涤液洗涤2次，每次 5-10 分钟。
11.加入细胞核染色液(DAPD)，室温染色5分钟左右。细胞核染色液的用量充分盖住样品即可，对于6孔板中的样品，通常加入 1ml细胞核染色液(DAPI)。
12.吸除细胞核染色液，用洗涤液洗涤3次，每次 3-5 分钟。
13.如果是6孔板等较大的孔板，可以滴加适当量的抗荧光灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察。如果是 96 孔板，通常可以在保留洗涤液的情况下直接进行观察和拍照，或使用高内涵分析仪进行拍照分析。Ki67的染色为绿色荧光，细胞核的DAPI染色为蓝色荧光。