CFSE / 7-AAD双染细胞毒性检测试剂盒

BB-42142
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  • 500T
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  • ¥900元
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产品概述 product description

贝博® BBcellProbe® CFSE/7-AAD双染细胞毒性检测试剂盒是利用细胞荧光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD对细胞进行染色,利用CFSE标记靶细胞,7-AAD标记死的靶细胞来区分不同的细胞,活的靶细胞成绿色,死的靶细胞成红色和绿色,从而检测细胞毒性作用。 根据不同的实验方案设计,可以用来检测化合物的细胞毒性作用。也可以用来检测杀伤性T细胞或NK细胞介导的细胞毒作用。 CFDA-SE是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料,可以标记活体细胞。CFDASE是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料,可以结合细胞内的蛋白质。CFDASE在结构上将酚羟基部位改造成AM体,所以自身不发荧光,荧光背景低,脂溶性高,能够轻易穿透细胞膜,进入细胞内的CFDASE的AM部位能被细胞内酯酶水解生成CFSE,通过共价结合赖氨酸侧链的氨基而掺入细胞内和细胞表面的蛋白,且结合后发出强的绿色荧光。CFSE的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合,固定在细胞内,不会漏出细胞外。CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核,在细胞核的荧光最强。 CFSE毒性小,不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单,且不用放射性同位素,不存在安全隐患。可以更快速,更准确和更安全地得到想要的实验数据。 CFSE/7-AAD标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞毒性检测。 一般试剂盒采用PI与CFSE联用,但是由于PI的发射波长是<625 nm,通常在FL2中检测,对CFSE的干扰大。而且由于波谱较宽,同时在FL3中也能测,所以用了PI最多再加一个CFSE,FL3就没法用了。PI还有一个重要的缺点是不容易清洗干净,使用后清洗流式细胞仪更加费时费物。 贝博® BBcellProbe® 7-AAD/CFSE试剂盒有效的解决了这些弊端,7-AAD的发射波长是650nm,只占用FL3通道进行检测,FITC、PE两个通道受影响都小,可以做三色分析。 CFSE标记细胞呈绿色荧光,荧光波长:λex=496 nm, λem=516 nm。流式检测时的激发波长可以选择488 nm,此时的发射波长为516nm,使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。7-AAD标记细胞呈红色荧光,流式检测时的激发波长可以选择488nm,此时的发射波长为650 nm,使用流式细胞仪检测时可以采用FL3 detection channel。 CFSE标记的细胞除了流式细胞仪检测细胞毒性外,还可单染后用于细胞增殖检测,或者用荧光酶标板定量活细胞数目,或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。 贝博® BBcellProbe® 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。

保存温度
2-8℃避光
注意事项
1.长期不用可以-20℃保存。
2.CFSE染色液避免反复冻融。
3.CFSE染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。
4.试剂拆封后请尽快使用完!
有效期
一年
检测方法
1.流式细胞仪
2.荧光显微镜
3.激光共聚焦
适用样本
动物细胞
产品应用
1.流式细胞仪
2.荧光显微镜
3.激光共聚焦
仪器准备
1.带有450nm滤光片的酶标仪 2. CO2培养箱
试剂准备
1.PBS 2.纯水
耗材准备
1.移液器及吸头 2.96孔培养板

使用注意事项
1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
2.染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。
3.CFSE母液极易水解,建议分装保存,分装后用封口膜密封管口,再用锡箔纸包裹,最后和干燥剂一起用塑料袋密封,≦-20℃冷冻保存。
4.冬天气温较低时CFSE溶解液会凝固,可先在37℃水浴至溶解液完全融解后再进行配制,配制过程中注意避免溶液凝固,保持温度至CFSE溶解完全。
5.CFSE工作液应现配现用,不能提前配制,因为CFSE吸水会分解,影响染色效果。
6.CFSE易被水解,在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。
7.CFSE标记细胞仅需5-15分钟即可完成。对于不同细胞,最佳标记时间需自行摸索。正式实验前,建议先做几个孔摸索染色浓度和加入CFSE试剂后的培养时间。
8.荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
9.以下实验步骤仅供参考,请根据实际的实验方案设计或参考相关文献为准。
10.必须设置全阴,CFSE单标,7-AAD单标的靶细胞的参照以设置流式。
使用方法
细胞CFSE染色:
1. 根据需要检测的细胞样品数,用HBSS将CFSE母液200-4000倍稀释,配制成CFSE染色工作液。不同的细胞需要根据预实验结果确定最佳染色浓度。如果荧光强度弱,可以适当提高CFSE的终浓度。如果背景太高,可以适当降低CFSE的终浓度,请摸索条件找到最佳浓度。
2. 将培养好的待测靶细胞消化后收集,用PBS洗涤2次。
3. 将待测细胞用染色工作液重悬,至细胞浓度大约107/ml。
4. 在37℃培养箱中避光孵育15-30分钟。
5. 加10倍体积的含血清培养基,400×g离心5分钟。
6. 离心后去上清,收集细胞,用HBSS或无血清培养基洗涤细胞1-2次,最后加入培养基重悬细胞。
7. 在37℃培养箱中孵育20-30分钟。

细胞模型制备:
1. 收集待检测的靶细胞。
2. 进行相应的毒性药物处理或者效应细胞处理。

细胞检测:
1. 收集制备好的毒性处理过的细胞模型。
2. 用200 μl HBSS重悬细胞,加入1 μl 7-AAD染色液,混匀。
3. 在2-8℃避光孵育10-60分钟。
4. 在400×g离心5分钟收集细胞。
5. 用500 μl HBSS或PBS重悬细胞。
6. 取500 μl细胞悬液,用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
7. 根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被7-AAD染上会出现在CFSE+7-AAD+区域,未杀伤的在CFSE+7-AAD-区域,得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性。

参考文献
1.Yifei Wang et al.
Self-responsive co-delivery system for remodeling tumor intracellular microenvironment to promote PTEN-mediated anti-tumor therapy
Nanoscale 2020

2.Yu-jing Wu et al.
CP-25 Attenuates the Activation of CD4+ T Cells Stimulated with Immunoglobulin D in Human
Frontiers in Pharmacology 2018

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