-20℃保存。

1. 长期不用可以-20℃保存。
2. 染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。
3. 染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4. 注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
5. 试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。
6. 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

1. 流式细胞仪
2. 荧光显微镜
3. 激光共聚焦

1. 悬浮细胞
2. 贴壁细胞

1. 激光共聚焦显微镜/流式细胞仪/荧光显微镜
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒

1. PBS缓冲液或者HBSS

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套

1. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3. 试剂A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
4. 试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
5. 由于Calcein-AM的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
6. Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
7. 试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
8. 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
9. 以下实验步骤仅供参考，以实际的样本和文献参考步骤进行调整。可以染色悬浮培养细胞、贴壁细胞、制备的细胞爬片、涂片等原位染色。

1. 染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
每10 ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100 μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10 ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20-200 μl稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
2. 收集样本细胞。
3. 用PBS洗涤细胞两次。
4. 用200μl染色工作液A将细胞重悬。
5. 在室温或37℃避光孵育15-20分钟。
6. 用PBS洗涤细胞。
7. 用200 μl染色工作液B将细胞重悬。
8. 在室温或37℃避光孵育2-5分钟。
9. 用PBS洗涤细胞。
10. 用适量PBS重悬细胞。
11. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为488 nm，最大发射波长为515 nm和617 nm。结果分析 ：
荧光显微镜下，使用488 nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。
用528 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。

1. 所有细胞都染上红色？
EthD-3浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化EthD-3的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

2. 细胞被同时染上绿色和红色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且EthD-3也为阳性。

1. XuekeSun JiaoSun BiaoDong et al.
Noninvasive temperature monitoring for dual-modal tumor therapy based on lanthanide-doped up-conversion nanocomposites
Biomaterials 2019 （IF=8.806）

2. Hang Liu et al.
ROS-sensitive biomimetic nanocarriers modulate tumor hypoxia for synergistic photodynamic chemotherapy
Biomaterials Science 2019 （IF=5.831）

3. Han Wang et al.
Comparison of 3D-printed porous tantalum and titanium scaffolds on osteointegration and osteogenesis
Materials Science and Engineering: C 2019 （IF=4.959）

4. Weiyu Shen et al.
Downregulation of KCTD12 contributes to melanoma stemness by modulating CD271
Cancer Biology & Medicine 2019 （IF=4.467）

5. Dandan Tan, Jinkun Wen, Lixia Li et al.
Inhibition of RhoA-Subfamily GTPases Suppresses Schwann Cell Proliferation Through Regulating AKT Pathway Rather Than ROCK Pathway
Frontiers in Cellular Neuroscience 2018 （IF=4.3）