2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

质谱分析

动物细胞/组织

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含5种独立的蛋白酶抑制剂Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

质谱分析

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
 提取液A在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。



细胞蛋白提取
1. 提取液准备：
每500μl冷的蛋白提取液A中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每500μl膜蛋白溶解液C中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个以上细胞，在4℃，500g条件下离心3-5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 细胞样品中加入400μl冷的试剂 A，充分混匀。
5. 在2-8℃条件下振荡20-30分钟，至细胞充分裂解，细胞沉淀明显减少。
6. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
7. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。
8. 在37℃，1000g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为50μl。
9. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
10. 用850μl冷的试剂C膜蛋白溶解液溶解下层膜蛋白部分，即得膜蛋白粗提液。
11. 在900μl膜蛋白粗提液样本中加入100μl试剂E，充分混匀。
12. 冰浴或4℃冰箱静置30分钟以上。
13. 在4℃，15000×g以上条件下离心15分钟。
14. 小心移除上层清液丢弃，留沉淀。
15. 将离心管倒置在吸水纸上干燥离心管。
16. 加入200μl试剂F到离心管中。
17. 在4℃，15000×g以上条件下离心15分钟。弃上清，留沉淀。
18. 将离心管倒置在吸水纸上干燥离心管。
19. 用40－100μl试剂G溶解蛋白沉淀，充分混匀。
20. 在4℃，10000×g条件下离心10分钟。
21. 收集上清用于下游实验。
22. 将蛋白样品透析处理或者脱盐柱脱盐处理后用于下游实验。

1.蛋白浓度低？
膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量以提高膜蛋白浓度。
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

3.膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最好采用低电压低电流电泳。
膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。

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Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharide inhibits subgroup J avian leucosis virus infection by directly blocking virus infection and improving immunity
Sci Rep. 2017 （IF=5.228）

2.Xiaoyun Lin, Shao Chen et al.
Chimerically fused antigen rich of overlapped epitopes from latent membrane protein 2 (LMP2) of Epstein–Barr virus as a potential vaccine and diagnostic agent
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Phage Display against Corneal Epithelial Cells Produced Bioactive Peptides That Inhibit Aspergillus Adhesion to the Corneas
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The Influence of Down-Regulation of Suppressor of Cellular Signaling Proteins by RNAi on Glucose Transport of Intrauterine Growth Retardation Rats
Pediatric Research 2011 Volume 69, Issue 6, pp 497-503 （IF=2.882）