2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。 2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

昆虫

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。 2.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。 3.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。 4.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.离心机2.振荡器3.匀浆机/匀浆器4.涡旋混匀器5.移液器6.冰箱7.冰盒

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）2.蛋白定量试剂盒

1.离心管2.吸头3.一次性手套

1.预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。 2.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 3.蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。 4.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 5.蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。 6.如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 7.可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。 8.下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。

细胞蛋白提取1. 提取液准备：每500 μl蛋白提取液B中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。2. 取5-10×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。【注】： 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。4. 每5-10×106个细胞中加入400 μl冷的提取液 A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2-8℃条件振荡20-30分钟。【注】： 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液稍微晃动即可。 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。5. 然后在4℃，12000×g条件下离心10分钟。6. 沉淀用PBS洗涤一次，然后在4℃，10000×g条件下离心5分钟，弃上清。7. 在沉淀中加入100-200 μl冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。【注】： 根据预实验后核蛋白浓度测定的情况，可调整使用量，一般在50-200 μl。8. 置2-8℃条件振荡30分钟，至沉淀明显减少甚至无明显沉淀。【注】： 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液稍微晃动即可。 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。9. 在4℃，10000×g条件下离心5分钟。10. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。11. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。组织蛋白提取1. 提取液制备：每500 μl蛋白提取液B中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。【注】： 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。2. 取适量昆虫组织样本，用手术剪刀尽可能剪碎，加冷PBS，用组织匀浆机/匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，冰上静置3分钟，将匀浆液吸入另一预冷的干净离心管。【注】： 果蝇等小型昆虫可以剪碎后直接匀浆处理。 较大的昆虫需要去除翅膀、腿、甲壳等。3. 在4℃，500×g条件下离心3分钟，弃上清。4. 每20-50 μl沉淀体积中加入200 μl冷的提取液 A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2-8℃条件振荡20-40分钟。【注】： 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液稍微晃动即可。 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。 也可按组织重量计，每20 mg加200 μl提取液A。5. 然后在4℃，12000×g条件下离心10分钟。6. 沉淀用PBS洗涤一次，然后在4℃，10000×g条件下离心5分钟，弃上清。7. 在沉淀中加入100-200 μl冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。8. 置2-8℃条件振荡30分钟。【注】： 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液稍微晃动即可。 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。9. 在4℃，10000×g条件下离心5分钟。10. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。11. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。【注】： 建议用BCA法进行蛋白定量。 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

1.核蛋白浓度低？ 核蛋白丰度较低，需要足够细胞数量提取，在条件允许的情况下，尽可能加大细胞量。注意用蛋白提取液AB处理时没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂AB的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀，至无明显沉淀。 2.用什么方法定量蛋白？ 建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂B中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。 3.提取的蛋白具有活性吗？ 本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.Wan Zhao et al. Interaction between endogenous microRNAs and virus-derived small RNAs controls viral replication in insect vectorsPLoS Pathogens 2022 （IF=7.464）