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产品概述
product description
贝博® BBproExtra® 非水溶性蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种动物实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织样品中提取水不可溶蛋白。
本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜、骨架等不可溶蛋白组份，包括细胞质膜、核膜、各种细胞器膜和骨架等不可溶蛋白组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。
本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA实验等下游蛋白研究实验。
本试剂盒提取的蛋白为变性蛋白，需要具有天然蛋白构象的活性非水溶性蛋白，请使用贝博其他货号的试剂盒（相关产品BB-311912）。
本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用贝博其他货号的试剂盒（相关产品BB-3181）。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品BB-38113）。
保存温度
2-8℃
注意事项
1. 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！
2. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等
适用样本
动物组织
仪器准备
1. 离心机
2. 振荡器
3. 匀浆机/匀浆器
4. 涡旋混匀器
5. 移液器
6. 冰箱
7. 冰盒
2. 振荡器
3. 匀浆机/匀浆器
4. 涡旋混匀器
5. 移液器
6. 冰箱
7. 冰盒
试剂准备
1. PBS缓冲液
2. 蛋白定量试剂盒
2. 蛋白定量试剂盒
耗材准备
1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
2. 吸头
3. 一次性手套
使用注意事项
1. 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
2. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
3. 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
4. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
5. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
6. 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
7. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
8. 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。
9. Western Blot实验内参可以选用beta-actin、GAPDH、Tubulin。
10. 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
i. g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000 rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。
2. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
3. 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
4. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
5. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
6. 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
7. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
8. 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。
9. Western Blot实验内参可以选用beta-actin、GAPDH、Tubulin。
10. 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
i. g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如: 转速为3000 rpm，有效离心半径为10 cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。
使用方法
1. 提取液准备：
每500 μl冷的蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取50-100 mg组织样本，用PBS洗干净，然后用手术剪刀尽可能剪碎，加入500 μl匀浆液A，用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆在14000×g条件下离心25分钟。弃上清，留沉淀。
4. 用0.5 ml洗涤液重悬沉淀。在14000×g条件下离心25分钟。弃上清，留沉淀。
5. 用0.5 ml洗涤液重悬沉淀。在14000×g条件下离心25分钟。弃上清，留沉淀。
6. 在沉淀中加入0.3 ml蛋白提取液，充分混匀。在4℃条件下振荡30-60分钟。
7. 在4℃，10000-14000×g条件下离心15分钟。
8. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到总不可溶蛋白。
9. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
每500 μl冷的蛋白提取液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取50-100 mg组织样本，用PBS洗干净，然后用手术剪刀尽可能剪碎，加入500 μl匀浆液A，用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆在14000×g条件下离心25分钟。弃上清，留沉淀。
4. 用0.5 ml洗涤液重悬沉淀。在14000×g条件下离心25分钟。弃上清，留沉淀。
5. 用0.5 ml洗涤液重悬沉淀。在14000×g条件下离心25分钟。弃上清，留沉淀。
6. 在沉淀中加入0.3 ml蛋白提取液，充分混匀。在4℃条件下振荡30-60分钟。
7. 在4℃，10000-14000×g条件下离心15分钟。
8. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到总不可溶蛋白。
9. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
常见问题分析
1. 蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长蛋白提取液的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2. 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3. 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长蛋白提取液的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2. 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3. 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
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